原位逆行灌注兔肾 IRI 模型的建立
来源：UC论文网2015-11-06 14:20
摘要：
原位逆行灌注法对引起肾脏缺血再灌注损伤的保护已有报道，但功能及结构的动态变化还未见报道，本实验旨在建立一个稳定的原位逆行灌注兔肾引起缺血再灌注损伤的模型，并观察不
原位逆行灌注法对引起肾脏缺血再灌注损伤的保护已有报道，但功能及结构的动态变化还未见报道，本实验旨在建立一个稳定的原位逆行灌注兔肾引起缺血再灌注损伤的模型，并观察不同时间内生化及病理方面的改变，为临床试验提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
选用 20 只健康成年雄性新西兰大白兔 ( 昆明医学院实验动物中心提供)，体质量2.2~2.5 Kg，实验前温度（22±2）℃，相对湿度为（55±2）%，环境中适应性饲养一周，术前晚8 h 禁食，不禁水。分组：随机分成 2 组，每组 10 只，对照组 : 顺行灌注组，即灌注时从肾动脉灌入灌注液，从肾静脉流出的方法灌洗肾脏；实验组：逆行灌注组，即灌注时从肾静脉灌入灌注液，从肾动脉流出的方法灌洗肾脏。
1.2 手术方法
2 % 戊巴比妥自耳缘静脉注射 ( 按 1.0 mL/ kg 体重 ) 麻醉，取腹正中切口，游离右肾至肾蒂，在右肾蒂处留置一根2-0 号丝线不打结，对照组分离左肾动脉长约 2 cm，左肾静脉分离至下腔静脉处，仔细分离从左肾静脉处向上发出的腰背静脉，长约 1.5 cm，远端打结，近端靠近肾静脉处留置5-0 号丝线不打结，用无创血管夹分别在肾动、静脉靠近下腔静脉处夹闭血管，并记录时间，在腰背静脉剪一小口作为灌注液的出口。显微剪刀在夹闭肾动脉侧处剪一小口，用24 G 密闭式静脉留置针，拔取针芯 , 外接一次性的静脉输液器插入小口内并固定，用 0~4 ℃高渗枸橼酸盐嘌呤溶液(HC-A) 肾灌注液 ( 上海长征医院制 ) 匀速灌注，压力为 100cmH2O，灌注至肾脏颜色变白，腰背静脉流出液清澈后停止灌注，9-0 无损伤缝合线连续缝合小口并确定无漏血及血管通畅，左腰背静脉近端靠近肾静脉处留置的 5-0 丝线打结，观察没有活动性出血，临时关闭腹腔，开放左肾动、静脉循环前收紧留置在右肾蒂处的丝线，向下分离右输尿管并结扎，切除右肾。60 min 时开放左肾动、静脉，见肾脏颜色由紫黑变为粉红后关闭腹腔。耳缘静脉补给生理盐水 20 mL ，内加入青霉素 20 万 U，兔子苏醒后放入笼中饲养。第 2 组在腰背静脉剪一小口灌注灌注液，肾动脉侧处剪一小口作为灌注液出口，余同对照组。
观察指标：2 组兔子术前取静脉血 1 mL，术后各取第 1、2、3、5、7 天静脉血，第 1 天取 2 mL，其他 4 d 各取 1 mL血，第 7 天取常规病理组织及电镜组织。肾脏标本采集将兔子麻醉、固定后沿原切口打开腹腔，直视下枪式肾活检穿刺针穿刺 3 条组织，立即放入 0~4 ℃的戊二醛液内固定，送昆明医学院电镜室观察肾小管超微结构，切除肾脏 1/2 以 10%甲醛固定，送昆明医学院病理教研室行 HE 染色。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 13.0 软件，数据以 x-±s 表示，均数间的比较用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
术后兔子存活好，取肾脏病检时可见肾脏充盈好，肾动、静脉没有栓塞或者闭塞。两组血清肌酐 (SCr)、尿素氮(BUN) 值在不同的时间点 ( 术后 1、2、3 d) 差异有统计学意义 (P<0.05)。逆行灌注组肾功能指标明显好于顺行灌注组，术前、术后第5、7天各组间均数差异没有统计学意义(P>0.05)见表 1、2。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
选用 20 只健康成年雄性新西兰大白兔 ( 昆明医学院实验动物中心提供)，体质量2.2~2.5 Kg，实验前温度（22±2）℃，相对湿度为（55±2）%，环境中适应性饲养一周，术前晚8 h 禁食，不禁水。分组：随机分成 2 组，每组 10 只，对照组 : 顺行灌注组，即灌注时从肾动脉灌入灌注液，从肾静脉流出的方法灌洗肾脏；实验组：逆行灌注组，即灌注时从肾静脉灌入灌注液，从肾动脉流出的方法灌洗肾脏。
1.2 手术方法
2 % 戊巴比妥自耳缘静脉注射 ( 按 1.0 mL/ kg 体重 ) 麻醉，取腹正中切口，游离右肾至肾蒂，在右肾蒂处留置一根2-0 号丝线不打结，对照组分离左肾动脉长约 2 cm，左肾静脉分离至下腔静脉处，仔细分离从左肾静脉处向上发出的腰背静脉，长约 1.5 cm，远端打结，近端靠近肾静脉处留置5-0 号丝线不打结，用无创血管夹分别在肾动、静脉靠近下腔静脉处夹闭血管，并记录时间，在腰背静脉剪一小口作为灌注液的出口。显微剪刀在夹闭肾动脉侧处剪一小口，用24 G 密闭式静脉留置针，拔取针芯 , 外接一次性的静脉输液器插入小口内并固定，用 0~4 ℃高渗枸橼酸盐嘌呤溶液(HC-A) 肾灌注液 ( 上海长征医院制 ) 匀速灌注，压力为 100cmH2O，灌注至肾脏颜色变白，腰背静脉流出液清澈后停止灌注，9-0 无损伤缝合线连续缝合小口并确定无漏血及血管通畅，左腰背静脉近端靠近肾静脉处留置的 5-0 丝线打结，观察没有活动性出血，临时关闭腹腔，开放左肾动、静脉循环前收紧留置在右肾蒂处的丝线，向下分离右输尿管并结扎，切除右肾。60 min 时开放左肾动、静脉，见肾脏颜色由紫黑变为粉红后关闭腹腔。耳缘静脉补给生理盐水 20 mL ，内加入青霉素 20 万 U，兔子苏醒后放入笼中饲养。第 2 组在腰背静脉剪一小口灌注灌注液，肾动脉侧处剪一小口作为灌注液出口，余同对照组。
观察指标：2 组兔子术前取静脉血 1 mL，术后各取第 1、2、3、5、7 天静脉血，第 1 天取 2 mL，其他 4 d 各取 1 mL血，第 7 天取常规病理组织及电镜组织。肾脏标本采集将兔子麻醉、固定后沿原切口打开腹腔，直视下枪式肾活检穿刺针穿刺 3 条组织，立即放入 0~4 ℃的戊二醛液内固定，送昆明医学院电镜室观察肾小管超微结构，切除肾脏 1/2 以 10%甲醛固定，送昆明医学院病理教研室行 HE 染色。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 13.0 软件，数据以 x-±s 表示，均数间的比较用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
术后兔子存活好，取肾脏病检时可见肾脏充盈好，肾动、静脉没有栓塞或者闭塞。两组血清肌酐 (SCr)、尿素氮(BUN) 值在不同的时间点 ( 术后 1、2、3 d) 差异有统计学意义 (P<0.05)。逆行灌注组肾功能指标明显好于顺行灌注组，术前、术后第5、7天各组间均数差异没有统计学意义(P>0.05)见表 1、2。
表 1 两组血清尿素氮比较 (n=10, x±s)
注：▲顺行灌注组与逆行灌注组差别无统计意义 (P>0.05)；△顺行灌注组与逆行灌注组差别有统计意义 (P<0.05)
表 2 两组血清肌酐比较 (n=10, x±s) 
表 2 两组血清肌酐比较 (n=10, x±s)
注：▲顺行灌注组与逆灌注组差别无统计行意义 (P>0.05)；△顺行灌注组与逆行灌注组差别有统计意义 (P<0.05)
二组兔肾在光镜下可见逆行灌注组近端小管上皮细胞轻度肿胀，肾小管结构完整，远端小管管腔扩张，部分细胞可见胞浆内空泡形成，组织周围渗出较顺行灌注组损伤轻。
3 讨论
从解剖学的观点来说，肾实质内静脉无节段性 , 各肾段之间存在丰富的吻合，经肾静脉灌注，如多支肾静脉，即使一支肾静脉畸形、损伤或太细，从另一支肾静脉灌注，也能迅速灌白整个肾脏。肾动脉在肾内的分布呈节段性，一般分为 5 个肾段，肾段之间的动脉缺乏交通支，当一支段动脉梗塞后可造成该肾段的坏死。
肾静脉逆行灌注肾脏可以更完全把兔子肾脏里血液灌注出来，减少血栓的形成，可以弥补由于肾动脉多支变异或畸形、狭窄、硬化等不易灌注的缺点。本实验采用原位逆行灌注兔子肾脏后的缺血再灌注损伤的方法，不需阻断腹主动脉和腔静脉，对兔子的生理干扰小，成功率高，可以较准确地观察肾脏缺血再灌注损伤术后的功能变化，为肾移植基础研究提供稳定、可靠的动物模型。我们实验兔子的右肾是在左侧肾脏开放循环时切除的，这样更准确观察左肾功能的变化情况。兔子的左肾静脉有一支腰背静脉，较粗，为避免肾静脉缝合后引起狭窄，我们分别在顺、逆行灌注组把左腰背静脉分离出来作为灌注液出口或灌注口，并在靠近肾静脉处留置结扎线，待灌注结束后结扎。
本实验灌注后动脉缝合时间一般为 2 min 左右，肾静脉不需缝合，直接把留置在左腰背静脉处的结扎线打结即可。各组肾脏缺血时间为 60 min，且除左侧肾脏缺血外，全身各组织、器官都没有太大影响，肾功能检测结果显示，术后兔肾血清 BUN、Cr 均显著升高，肾组织学检查可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，部分肾小管凝固性坏死，肾小管腔内可见到管型，说明肾 IRI 模型复制成功。实验结果表明，两组兔SCr、BUN 都在第 3 天升到最高，第 5 天都基本降到了正常值，在第 3 天逆行灌注组与顺行灌注组相比，顺行灌注组兔SCr、BUN 水平显著升高，肾组织病理学及电镜也改变明显(P<0.05); 第 7 天两组兔 SCr、BUN 都恢复到了正常值，肾组织病理学及电镜显示：逆行灌注组比顺行灌注组损伤轻，差异有统计学意义 (P<0.05)，与尹明等研究结论相一致。IL-1 是一种在炎症反应中最早出现的、发挥前炎症因子作用的反应强烈的细胞因子。目前已证明 IL - 1 在各种缺血再灌注损伤中起着重要作用。Furuichi 等研究证明在肾脏缺血再灌注损伤时 IL-1 的表达明显升高 ，但 IL - 1 在缺血性肾损伤中的具体作用机制还不十分明确 , 我们只做了兔子肾缺血再灌注 24 h 血液 IL-1 的浓度 , 顺行灌注组与逆行灌注组比较 ，异有统计学意义 (P<0.01) ，这表明逆行灌注较顺行灌注更有保护作用。
本实验只做了动物实验的初步研究，逆行灌注法对肾功能方面的保护需我们做进一步的基础及临床研究。
二组兔肾在光镜下可见逆行灌注组近端小管上皮细胞轻度肿胀，肾小管结构完整，远端小管管腔扩张，部分细胞可见胞浆内空泡形成，组织周围渗出较顺行灌注组损伤轻。
3 讨论
从解剖学的观点来说，肾实质内静脉无节段性 , 各肾段之间存在丰富的吻合，经肾静脉灌注，如多支肾静脉，即使一支肾静脉畸形、损伤或太细，从另一支肾静脉灌注，也能迅速灌白整个肾脏。肾动脉在肾内的分布呈节段性，一般分为 5 个肾段，肾段之间的动脉缺乏交通支，当一支段动脉梗塞后可造成该肾段的坏死。
肾静脉逆行灌注肾脏可以更完全把兔子肾脏里血液灌注出来，减少血栓的形成，可以弥补由于肾动脉多支变异或畸形、狭窄、硬化等不易灌注的缺点。本实验采用原位逆行灌注兔子肾脏后的缺血再灌注损伤的方法，不需阻断腹主动脉和腔静脉，对兔子的生理干扰小，成功率高，可以较准确地观察肾脏缺血再灌注损伤术后的功能变化，为肾移植基础研究提供稳定、可靠的动物模型。我们实验兔子的右肾是在左侧肾脏开放循环时切除的，这样更准确观察左肾功能的变化情况。兔子的左肾静脉有一支腰背静脉，较粗，为避免肾静脉缝合后引起狭窄，我们分别在顺、逆行灌注组把左腰背静脉分离出来作为灌注液出口或灌注口，并在靠近肾静脉处留置结扎线，待灌注结束后结扎。
本实验灌注后动脉缝合时间一般为 2 min 左右，肾静脉不需缝合，直接把留置在左腰背静脉处的结扎线打结即可。各组肾脏缺血时间为 60 min，且除左侧肾脏缺血外，全身各组织、器官都没有太大影响，肾功能检测结果显示，术后兔肾血清 BUN、Cr 均显著升高，肾组织学检查可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，部分肾小管凝固性坏死，肾小管腔内可见到管型，说明肾 IRI 模型复制成功。实验结果表明，两组兔SCr、BUN 都在第 3 天升到最高，第 5 天都基本降到了正常值，在第 3 天逆行灌注组与顺行灌注组相比，顺行灌注组兔SCr、BUN 水平显著升高，肾组织病理学及电镜也改变明显(P<0.05); 第 7 天两组兔 SCr、BUN 都恢复到了正常值，肾组织病理学及电镜显示：逆行灌注组比顺行灌注组损伤轻，差异有统计学意义 (P<0.05)，与尹明等研究结论相一致。IL-1 是一种在炎症反应中最早出现的、发挥前炎症因子作用的反应强烈的细胞因子。目前已证明 IL - 1 在各种缺血再灌注损伤中起着重要作用。Furuichi 等研究证明在肾脏缺血再灌注损伤时 IL-1 的表达明显升高 ，但 IL - 1 在缺血性肾损伤中的具体作用机制还不十分明确 , 我们只做了兔子肾缺血再灌注 24 h 血液 IL-1 的浓度 , 顺行灌注组与逆行灌注组比较 ，异有统计学意义 (P<0.01) ，这表明逆行灌注较顺行灌注更有保护作用。
本实验只做了动物实验的初步研究，逆行灌注法对肾功能方面的保护需我们做进一步的基础及临床研究。
