西汀对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护

　　肾缺血再灌注(IR)是一常见的临床问题，肾移植、肾部分切除术、肾部分血管成形术、休克复苏等均可造成不同程度的肾IR损伤，是造成急性肾衰竭和移植肾功能恢复延迟的主要原因。其病理损伤机制比较复杂，主要涉及氧化应激、炎症因子的释放和细胞凋亡等。长春西汀是从夹竹桃科小蔓长春花提取的生物碱，临床上一直用于缺血性脑血管疾病的治疗和预防，它在脑、肝等IR损伤中的保护作用已被报道，但其在肾IR的作用还是未知的。本研究旨在探讨长春西汀在肾IR损伤中的保护作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　健康雄性昆明白小鼠，体质量30～40g(滨州医学院动物实验中心)。长春西汀注射液购自山东瑞阳制药有限公司。小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒购自达科为生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白水平测定试剂盒购自烟台赛尔斯生物技术有限公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物分组和模型制备　将小鼠分成4组：(1)假手术组(n=8);(2)IR组(n=8);(3)长春西汀低剂量干预组(n=8);(4)长春西汀高剂量干预组(n=8)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10mg/kg)腹腔麻醉后仰卧在手术台上，腹部备皮、消毒后正中切口，游离左右肾蒂，假手术组不夹闭，其余3组分别用无损伤血管夹夹闭，45min后松开恢复血流，以肉眼观察肾脏颜色变化来判断肾脏缺血或再灌注是否成功。长春西汀低剂量和高剂量干预组分别在术前1h腹腔注射长春西汀10mg/kg和20mg/kg;假手术组和IR组同时给予等量生理盐水。再灌注24h后打开腹腔，下腔静脉取血分离血清，取一部分肾组织Bouin氏液固定，剩余肾组织用冰磷酸盐缓冲液漂洗后-70℃保存。

　　1.2.2　组织学评价　取小鼠肾组织，Bouin氏液固定24h，常规制备石蜡切片，脱蜡水化后用 HE试剂盒染色，光镜下观察肾脏的组织形态变化。

　　1.2.3　血清指标检测　血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平采用全自动生化分析仪(美国德灵 Dimension　RXL　Max)测定。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

　　1.2.4　肾组织中 MDA水平和SOD活性检测　 称1g肾组织，放入玻璃匀浆器中，加冷生理盐水在冰上研磨成10%的组织匀浆，3　000r/min低温离心10min后取上清液，分别按照试剂盒操作步骤对 MDA水平和SOD活性进行检测。蛋白浓度用BCA蛋白水平测定试剂盒检测。

　　1.3　统计学处理　采用SPSS18.0统计学软件进行分析，计量资料采用x±s表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　　果

　　2.1　肾组织形态学变化　见图1。HE染色可见假手术组肾小球和肾小管结构正常，发现IR组肾小管排列紊乱，管腔扩张，部分刷状缘消失;肾小管上皮细胞肿胀，坏死;管腔内可见管型;肾间质炎症细胞浸润。长春西汀干预后肾组织病理损伤减轻，其中高剂量干预组损伤改善更显著，可见肾小管结构完整，排列整齐，管腔内管型减少，炎症细胞少见。

　　2.2　4组肾功能指标变化　见表1。与假手术组相比，IR组SCr和BUN水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);长春西汀干预组SCr和BUN与IR组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);长春西汀高、低剂量干预组SCr和BUN差异也有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3　血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6结果比较　见表2。与假手术组相比，小鼠肾IR可引起细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。用长春西汀预处理后，与IR组相比，TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量组降低更显著，与低剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4　肾组织中 MDA水平和SOD活性变化　见表3。与假手术组比较，IR组肾组织中 MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD 活性明显降低，差异也有统计学意义(P<0.05);长春西汀低剂量干预组与IR组相比，MDA 水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD活性虽有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05);高剂量干预组与IR组相比，MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SOD 活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3　讨论

　　本研究采用夹闭双侧肾蒂造成肾缺血45min再恢复血供的方法建立小鼠肾IR损伤模型。术后24h，IR组小鼠SCr和BUN升高，肾组织病理损伤明显，提示肾脏IR模型制备成功。给予长春西汀干预后，SCr和BUN水平降低，肾组织病理损伤减轻，由此提示长春西汀干预处理可以改善肾IR损伤程度。肾IR损伤中有众多的炎症介质和免疫因子参与，TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高已经成为肾IR 炎症的重要标志。TNF-α是活化单核细胞产生的多活性细胞因子，其能刺激单核巨噬细胞合成和分泌IL-1β和IL-6等炎症因子。本研究中IR组TNF-α、IL-1β和IL-6表达升高，证明有炎症参与了组织损伤。长春西汀干预组相对IR组 TNF-α、IL-1β和IL-6表达降低，提示长春西汀可以通过抑制炎症改善肾IR损伤。研究表明，长春西汀作为磷酸二酯酶抑制剂，能够抑制炎症相关因子，如核转录因子NF-κB和TNF-α的表达，从而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎症因子的表达，起到保护组织的作用。氧自由基的生成被认为是IR损伤中最重要的发病机制之一。大量氧自由基能够攻击细胞膜的脂质和蛋白质，导致脂质过氧化，破坏组织的结构和功能。MDA是脂质过氧化的产物之一，能够直接反映组织损伤程度。SOD是一种重要的抗氧化酶，能够保护细胞免受氧自由基的攻击。本研究中与假手术组相比，小鼠IR后肾脏中 MDA 水平升高，SOD活性降低，表明肾IR后氧自由基产生增多，损伤了肾小管上皮细胞。有研究表明，长春西汀另一个保护作用机制就是它能够清除羟自由基和其他活性氧而发挥显著的抗氧化活性，这与本研究结果相符。

　　本研究发现，长春西汀干预组肾组织SOD活性升高，MDA水平有所降低，由此表明长春西汀能够保护内源性SOD活性，抑制脂质过氧化，从而发挥保护作用。综上所述，长春西汀干预处理能够降低小鼠肾IR后的炎症和氧化损伤，保护肾功能，为临床预防治疗急性肾损伤提供了新思路。