消支饮治疗小鼠生殖道解脲支原体感染对血清干扰素

　　解脲支原体(Uu) 是介于细菌与病毒之间的最小原核微生物, 属于柔膜体纲、支原体科、脲原体属的微生物。主要寄生在人类泌尿生殖道黏膜表面, 女性生殖道感染后可上行至子宫腔和输卵管腔引起相应部位的炎症。针对其病因病机导师梁学林教授制定了以健脾益气, 升阳除湿为主, 佐以清热解毒杀虫的治疗大法, 自拟“消支饮”方治疗本病, 注重扶正祛邪, 固护正气, 尤其对抗生素治疗耐药的患者更为适宜。通过动物实验以中药“消支饮”方, 治疗Uu 感染, 并设西药“阿奇霉素”为对照组, 从小鼠Uu 转阴率、血清干扰素-γ 两方面观察“消支饮”的治疗作用。

　　1　材料与试剂

　　1. 1　实验动物　BALB/C 小鼠104 只购于中国医学科学院实验动物研究所, 鼠龄8 周, 雌性, 清洁级, 体重(20±2)g。

　　1. 2　实验药品及制备　消支饮：由太子参、山药、柴胡、炙甘草、陈皮、白芍、炒荆芥、车前子、苍术、炒白术、黄柏、苦参等中草药组成, 由辽宁中医药大学附属医院中药局制备,浓缩至2 g/ml( 即1 ml 煎液内含有2 g 生药), 灭菌备用。

　　阿奇霉素：石家庄欧意药业有限公司生产, 规格：0.25 g/片,生产批号：国药准字H10980218。

　　1. 3　主要试剂　Uu 标准株：Uu 血清8 型冻干标准株, 由南华大学微生物教研室提供。复苏并传代后备用。

　　液体培养基：购于珠海丽珠试剂有限公司, 批号：YZB/粤0205-2007。

　　固体培养基：购于上海恩康生物科技有限公司, 批号：YZB/ 沪0948-40-2005。

　　小鼠IFN-γ 定量酶联检测试剂盒：购于ADLITTERAMDIAGNOSTIC LABORATORIES, 批号：QRCT-301330101003-EIA/UTL。

　　1. 4　主要仪器及设备　酶联免疫吸收分析仪, 型号Anthos-2010, 用于测定血清IFN-γ ;日本奥林巴斯BX51 号显微镜,用于小鼠阴道分泌物Uu 检测观察。

　　2　实验方法

　　2. 1　Uu 菌液制备　将冻于-80℃的Uu 血清8 型标准株置37~45℃水浴中1 min, 使其快速融化, 无菌接种于Uu 液体培养基, 37℃恒温箱培养24~48 h, 见液体培养基由黄变红, 且液体澄清透亮无浑浊、沉淀, 可确认有Uu 生长。取对数生长期Uu 菌液制成2.5×105 ccu/ml 浓度, 经1000 r/min 4℃离心集菌备用。

　　2. 2　动物造模　在同样条件下, 随机分为A、B、C、D、E、F、G 7 组。模拟Taylor-Robinson 的造模方法, A、B、C、D、E、F 组每只小鼠颈部皮下注射苯甲酸雌二醇0.4 mg, 浓度1mg/ml, 每周1 次, 共4 次。A、B、C、D、E、F 组小鼠在经过雌激素预处理后, 将血清8 型浓度为2.5×105 cuu/ml 的Uu菌液用留滞针软管取20 μl 注入小鼠阴道, 连续给菌3 d。小鼠在接种Uu 1 周后取小鼠阴道分泌物进行检测。用2 支无菌棉签棒伸入小鼠阴道0.5 cm 轻轻转动, 将第1 支棉签在液体培养基(1 ml) 中充分洗脱, 进行液体培养;第2 支棉签接种于Uu 固体培养基平板上。固体和液体培养基均放于37℃孵育箱孵育, 24~48 h 后观察结果, 液体培养基颜色由黄变红且澄清, 固体培养基长出典型“煎蛋样”Uu 菌落, 提示造模成功。

　　2. 3　分组给药治疗　消支饮预防高剂量组(A 组：14 只小鼠,造模同时, 给予中药“消支饮”80 g/(kg·d), 连续给药4 周;消支饮预防低剂量组(B 组) ：14 只小鼠, 造模同时, 给予中药“消支饮”20 g/(kg·d), 连续给药4 周;消支饮治疗高剂量组(C 组)：17 只小鼠, 造模成功后, 给予中药“消支饮”80g/(kg·d), 连续给药3 周;消支饮治疗低剂量组(D 组) ：17只小鼠, 造模成功后, 给予中药“消支饮”20 g/(kg·d), 连续给药3 周;阿奇霉素组(E 组) ：14 只小鼠, 造模成功后,给予西药“阿奇霉素”0.2 g/(kg·d), 连续给药2 周;模型组(F组) ：16 只小鼠, 造模成功后, 给予0.9% 的生理盐水, 连续3 周;空白组(G 组) ：12 只小鼠, 正常饲养, 与模型组同时给予0.9% 的生理盐水, 连续3 周;灌胃量：每10 g 小鼠给0.4ml 的药液, 每天给药1 次。

　　2. 4　实验检测指标　小鼠转阴率的检测：实验给药结束后,全部小鼠取阴道分泌物进行检测。24~48 h 后观察结果。于奥林巴斯BX51 号显微镜下观察并拍照。

　　小鼠血清中IFN-γ 值检测：用消毒眼科镊取出小鼠眼球, 取小鼠眼球血, 应用酶联免疫吸收分析仪检测血清IFN-γ 值。

　　2. 5　统计学方法　采用SPSS17.0 统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采用率(%) 表示, 行χ2 检验;计量资料应用LSD-t 检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

　　3　结果

　　小鼠在接种Uu 1 周后取小鼠阴道分泌物进行检测。液体及固体培养基检测结果显示：A、B、C、D、E、F 组小鼠均感染了Uu, 感染率100%, 空白组12 只小鼠均未感染Uu,感染率0。证明实验造模成功。

　　3. 1　治疗后Uu 转阴率

　　3. 2　血清IFN-γ 检测　取小鼠眼球血, 离心分离出血清,采用酶联免疫吸附法, 由酶联免疫吸收分析仪读取结果, 换算出最后IFN-γ 值。基本步骤①取出酶标板, 依照次序对应分别加入100 μl 的标准品于空白微孔中;②分别标记样品编号, 加入100 μl 样品于空白微孔中;③在标准品孔和样品孔中加入50 μl 的酶标记溶液;④ (36±2)℃孵育反应60min ;⑤洗板机清洗5 次, 每次静置10~20 s ;⑥每孔加入底物A、B 液( 呈色剂) 各50 μl ;⑦ (36±2)℃下避光孵育反应15 min ;⑧每孔加入50 μl 终止液, 终止反应。

　　结果判断：于波长450 nm 的酶标仪上读取各孔的OD 值;B= 标准品OD 值、B0= 标准品0 点OD 值;以B/B0% 值为纵坐标, 以标准品的浓度为横坐标, 在对数坐标纸上绘制标准曲线;在标准曲线上查找对应的浓度范围;敏感度为1.0pg/ml, 根据样品OD 值在该曲线图上查出相应小鼠IFN-γ 含量。

　　4　讨论

　　4. 1　本实验研究的结果分析

　　4. 1. 1　治疗后转阴率分析　各组小鼠治疗4 周后对小鼠分泌物Uu 检测结果说明, 消支饮和阿奇霉素对Uu 感染均有治疗作用。本实验属于急性Uu 感染, 根据转阴率可以说明, 阿奇霉素对急性Uu 感染的抑菌作用优于消支饮, 且消支饮高剂量组疗效优于低剂量组。

　　4. 1. 2　干扰素-γ 值分析　国内外专家研究发现Uu 发病与免疫因素有关, 其中IFN-γ 由活化的T 细胞产生, 是迟发型超敏反应(DHSR) 中最重要的细胞因子, 多位学者认为, 在Uu感染致病过程中与输卵管损伤有关。Shcheglovitova 等发现Uu 感染妇女血清IFN-γ 水平升高。袁淑珍通过研究发现输卵管支原体感染不孕妇女输卵管液中IFN-γ 水平升高,认为支原体感染引起的输卵管炎症导致不孕可能与IFN-γ升高有关。IFN-γ 作为免疫细胞因子, 在正常情况下, 对机体有保护作用;如其过度表达, 则引起免疫损伤。韩延华等用80 只小鼠做Uu 感染后血清IFN-γ 的动物实验研究, 通过自拟方剂消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素治疗, 结果发现消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素均能降低Uu 感染引起的血清IFN-γ 的水平升高, 说明通过治疗与防治, 可能影响Uu 感染引起的血清IFN-γ 的高水平。

　　本实验采用酶联免疫吸附法, 检测各组小鼠血清中IFN-γ 值, 应用LSD-t 检验方法统计结果表明：小鼠感染Uu 后, IFN-γ 值有上升趋势。用药治疗后：①各组与模型组比较, 其中消支饮预防低剂量组与模型组比较, 差异有统计学意义(P<0.05), 说明消支饮能降低Uu 感染引起的IFN-γ高水平。②各组与阿奇霉素组比较, 其中消支饮预防低剂量组与阿奇霉素组比较, 差异有统计学意义(P<0.05), 说明消支饮较阿奇霉素更能降低Uu 感染引起的IFN-γ 高水平。

　　通过本次实验研究, 可以看出消支饮是治疗Uu 感染的有效方剂。该方不仅能有效改善Uu 感染引起的生殖道组织炎症, 且能降低Uu 感染引起的IFN-γ 高水平, 能整体调节机体的免疫功能, 与现代研究认为Uu 致病与免疫因素有关是相一致的。而且这为中医药治疗Uu 感染开辟了新途径,提供了理论依据。