NaF对RAW264.7细胞活力的影响
来源：UC论文网2015-11-06 14:19
摘要：
全身暴露于过量氟（F）可导致骨稳态和牙釉质的发展受到干扰，过量氟引起的骨病变中，破骨性吸收占相当重要的位置，虽然过度破骨性吸收是氟骨症致残的一个重要因素，但对破骨细
全身暴露于过量氟（F）可导致骨稳态和牙釉质的发展受到干扰，过量氟引起的骨病变中，破骨性吸收占相当重要的位置，虽然过度破骨性吸收是氟骨症致残的一个重要因素，但对破骨细胞的活动研究很少。2012 年我们采用小鼠破骨细胞前体细胞 RAW264.7构建体外破骨细胞染氟模型，观察破骨细胞染氟过程中的细胞增殖和分泌特异产物基质金属蛋白酶9（ma-trix metalloproteinase-9，MMP-9）和组织蛋白酶 K(ca-thepsin K)表达的影响。
1 材料与方法
1.1 破骨细胞前体细胞 RAW264.7 的培养 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7（购自中国科学院细胞库)，用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM，Gibco，美国）培养液于 37℃、5% CO 培养箱中培养。每3天换液一次，细胞增殖至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶室温消化后计数备用。MMP-9和组织蛋白酶K纯化多克隆抗体购于北京博奥森公司。
1.2 破骨细胞的诱导分化及鉴定 ①抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色：RAW264.7细胞以2×103个/孔接种于24孔板，培养24 h 后用含终质量浓度为 50 μg/L RANKL 和 50 μg/L小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子 （macrophage colonystimulating factor，M-CSF）的 DMEM 诱导分化剂。分别于诱导后第一、三、五和七天行TRAP染色。镜下破骨细胞呈多核巨细胞，TRAP阳性表现为酒红色颗粒。②破骨细胞特异性基因检测：用免疫组织化学的方法测定诱导后的染氟细胞内基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K的表达，观察并用Image-Pro Express图像分析软件镜下扫描灰度。
1.3 接种细胞和分组小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞浓度 5×104个/ml接种24孔板，每孔加2 ml 培养基。按 NaF 浓度分组：对照组（NaF 浓度为0mg/L）占 6 孔/板；实验组每个 NaF 浓度（2 mg/L、10mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）占 6 孔/板。按时间分组：对照组、实验组按时间分为24 h组、48 h组、72 h组，分别接种6块板。
1.4 细胞活力测定 甲基偶氮唑蓝（4，5-Dimethylthi-azol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定生长抑制率。细胞悬液以5×104个/ml浓度接种于96 孔板。每组设 3 个平行孔，并设空白对照。贴壁培养24 h后分别加入不同处理因素，并测定不同作用时间（24、48、72 h）和不同浓度F的吸光度d值。
1.5 统计学分析 采用 Spss 13.0 软件进行统计，方差齐的多组比较采用单因素变量多因素方差分析，检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力的影响 空白组（NaF浓度为0 mg/L）与实验组（NaF浓度为2 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）相比较，除NaF浓度为2 mg/L组与空白组比较差异无统计学意义（t=7.276，P>0.05）外，其余各组平均值低于空白组，差异有统计学意义（t=6.74、7.32、11.87、15.93、24.38，均 P<0.05），表明 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力有抑制作用。在受试后的48 h，各实验组与空白组比较，仅60 mg/L（t=13.14)和80 mg/L（t=15.01）组差异有统计学意义（P<0.01），其余各组与对照组（0.43±0.002 16）相比，差异无统计学意义（t=0.46，P>0.05）。在受试后的72 h，与对照组（0.406 667±0.010 842）比较，仅80 mg/L组差异有统计学意义（t=6.25，P<0.01），其余各组与对照组相比，差异无统计学意义（t=1.76，P>0.05），见表 1。
表1 实验组和空白组在3个时间点细胞活力的比较(x ±s)
1 材料与方法
1.1 破骨细胞前体细胞 RAW264.7 的培养 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7（购自中国科学院细胞库)，用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM，Gibco，美国）培养液于 37℃、5% CO 培养箱中培养。每3天换液一次，细胞增殖至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶室温消化后计数备用。MMP-9和组织蛋白酶K纯化多克隆抗体购于北京博奥森公司。
1.2 破骨细胞的诱导分化及鉴定 ①抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色：RAW264.7细胞以2×103个/孔接种于24孔板，培养24 h 后用含终质量浓度为 50 μg/L RANKL 和 50 μg/L小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子 （macrophage colonystimulating factor，M-CSF）的 DMEM 诱导分化剂。分别于诱导后第一、三、五和七天行TRAP染色。镜下破骨细胞呈多核巨细胞，TRAP阳性表现为酒红色颗粒。②破骨细胞特异性基因检测：用免疫组织化学的方法测定诱导后的染氟细胞内基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K的表达，观察并用Image-Pro Express图像分析软件镜下扫描灰度。
1.3 接种细胞和分组小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞浓度 5×104个/ml接种24孔板，每孔加2 ml 培养基。按 NaF 浓度分组：对照组（NaF 浓度为0mg/L）占 6 孔/板；实验组每个 NaF 浓度（2 mg/L、10mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）占 6 孔/板。按时间分组：对照组、实验组按时间分为24 h组、48 h组、72 h组，分别接种6块板。
1.4 细胞活力测定 甲基偶氮唑蓝（4，5-Dimethylthi-azol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定生长抑制率。细胞悬液以5×104个/ml浓度接种于96 孔板。每组设 3 个平行孔，并设空白对照。贴壁培养24 h后分别加入不同处理因素，并测定不同作用时间（24、48、72 h）和不同浓度F的吸光度d值。
1.5 统计学分析 采用 Spss 13.0 软件进行统计，方差齐的多组比较采用单因素变量多因素方差分析，检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力的影响 空白组（NaF浓度为0 mg/L）与实验组（NaF浓度为2 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）相比较，除NaF浓度为2 mg/L组与空白组比较差异无统计学意义（t=7.276，P>0.05）外，其余各组平均值低于空白组，差异有统计学意义（t=6.74、7.32、11.87、15.93、24.38，均 P<0.05），表明 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力有抑制作用。在受试后的48 h，各实验组与空白组比较，仅60 mg/L（t=13.14)和80 mg/L（t=15.01）组差异有统计学意义（P<0.01），其余各组与对照组（0.43±0.002 16）相比，差异无统计学意义（t=0.46，P>0.05）。在受试后的72 h，与对照组（0.406 667±0.010 842）比较，仅80 mg/L组差异有统计学意义（t=6.25，P<0.01），其余各组与对照组相比，差异无统计学意义（t=1.76，P>0.05），见表 1。
表1 实验组和空白组在3个时间点细胞活力的比较(x ±s)
注：a. 与对照组比较，P<0.05；b. 与对照组比较，P<0.01。
2.2 NaF 浓度和作用时间对 RAW264.7 细胞活力的 影响 0 mg/L时，48 h和72 h的细胞OD值均高于24h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=5.21、6.03，P<0.05）；72 h 的细胞 OD 值低于 48 h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=4.77，P<0.05）。在NaF浓度为2 mg/L时，48 h的 OD 值高于 72 h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=9.91，P<0.05）；48 h 和 72 h 的细胞 OD 值均高于 24 h的OD值，即0 mg/L和2 mg/L组的3个时间OD值变化规律一致。当NaF浓度≥10 mg/L 时，48 h 的细胞OD 值均高于 24 h，但 72 h 均下降，且与 24 h 的细胞OD 值比较差异无统计学意义（t=0.21，P>0.05）。当NaF 浓度为 80 mg/L 时，3 个时间点的细胞活力差异无统计学意义（t=1.76，P>0.05）。
2.3 氟对体外诱导分化培养的破骨细胞 MMP-9 和组织蛋白酶K蛋白质表达的影响 氟对两种蛋白表达的影响结果见表2和表3。实验结果表明，在（10～40）mg/L 氟浓度作用 48 h 能使破骨细胞内 MMP-9 升高，差异有统计学意义（t=6.51，P<0.05）；在24 h和72h 各剂量的氟对细胞内的 MMP-9 蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.09，P>0.05）。而氟对组织蛋白酶K的表达只在80 mg/L氟作用72 h时，能显著降低在破骨细胞内的表达。
表2 氟对破骨细胞MMP-9蛋白质表达的影响(x ±s)
2.2 NaF 浓度和作用时间对 RAW264.7 细胞活力的 影响 0 mg/L时，48 h和72 h的细胞OD值均高于24h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=5.21、6.03，P<0.05）；72 h 的细胞 OD 值低于 48 h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=4.77，P<0.05）。在NaF浓度为2 mg/L时，48 h的 OD 值高于 72 h 的 OD 值，差异有统计学意义（t=9.91，P<0.05）；48 h 和 72 h 的细胞 OD 值均高于 24 h的OD值，即0 mg/L和2 mg/L组的3个时间OD值变化规律一致。当NaF浓度≥10 mg/L 时，48 h 的细胞OD 值均高于 24 h，但 72 h 均下降，且与 24 h 的细胞OD 值比较差异无统计学意义（t=0.21，P>0.05）。当NaF 浓度为 80 mg/L 时，3 个时间点的细胞活力差异无统计学意义（t=1.76，P>0.05）。
2.3 氟对体外诱导分化培养的破骨细胞 MMP-9 和组织蛋白酶K蛋白质表达的影响 氟对两种蛋白表达的影响结果见表2和表3。实验结果表明，在（10～40）mg/L 氟浓度作用 48 h 能使破骨细胞内 MMP-9 升高，差异有统计学意义（t=6.51，P<0.05）；在24 h和72h 各剂量的氟对细胞内的 MMP-9 蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.09，P>0.05）。而氟对组织蛋白酶K的表达只在80 mg/L氟作用72 h时，能显著降低在破骨细胞内的表达。
表2 氟对破骨细胞MMP-9蛋白质表达的影响(x ±s)
注：a. 与对照组比较，P<0.05。
表3 氟对破骨细胞组织蛋白酶K蛋白质表达的影响(x ±s)
注：a. 与对照组比较，P<0.05。
3 讨 论
小鼠RAW264.7细胞作为一种单核巨噬细胞系，是体外研究破骨细胞分化的经典细胞系，因为该细胞系可以在RANKL诱导的情况下稳定分化为形态和功能均成熟的破骨细胞。本研究发现：①时间与NaF浓度交互作用对RAW264.7细胞活力的影响：NaF浓度对RAW264.7细胞活力有抑制作用，但并未使细胞死亡，而是细胞活性降低。随着时间延长，细胞活性逐渐增强，说明NaF对RAW264.7细胞活力的抑制是暂时性的，随着时间的延长NaF对RAW264.7细胞活力 的 抑 制 作 用 在 减 弱 。 ② 本 实 验 未 见 NaF 对RAW264.7 细胞活力有促进作用。NaF 只是暂时取代了RAW264.7细胞与活力有关的代谢因子，如果NaF浓度与此因子相当，则代谢平衡不变；如NaF浓度为20 mg/L（浓度高或低），与此因子浓度不相当，则暂时打破了这种平衡，但这种取代可能是可逆的，随时间延长而恢复，即NaF对RAW264.7细胞的作用是有限的。这种因子可能与RAW264.7细胞的周期活动相关的基因有关。龙丽、马雷等研究发现，氟对破骨细胞的作用剂量过低（F含量远小于1 mg/L），所得结果与常识不符合，很可能与选择兔细胞有关。本研究的结果与华坤、范哲和杜光等的研究基本一致，区别在本研究的剂量范围较广。氟对破骨细胞具有直接的作用，从细胞活力看，早期（24 h）以损伤作用为主，但在48 h显示细胞从损伤状态恢复。
MMP-9 主要在破骨细胞、骨髓单核细胞和一些骨基质表面衬细胞中表达。MMP-9通过降解细胞外基质，在破骨细胞的迁移、侵蚀和锚着过程中发挥作用，应用免疫组织化学方法观察氟对培养的大鼠破骨细胞MMP-9的影响，结果表明，随染氟剂量的增加，MMP-9阳性细胞数逐渐增多，以10mg/L、20mg/L、40 mg/L 组最为明显，与对照组比较差异有统计学意义（t=6.51，P<0.05）。说明氟可通过提高MMP-9的蛋白质表达引起骨吸收活性的增加。
组织蛋白酶K（cathepsin K）属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成员，1999年克隆成功，又称作 cathepsin O2，cathepsin X，cathepsin O。与其他组织蛋白酶不同，组织蛋白酶K具有分解骨组织中主要胶原（Ⅰ型胶原）的端肽区及螺旋状结构的能力发挥降解骨胶原的功能。而Ⅰ型胶原蛋白是含量最多的骨基质蛋白，占整个基质的90%，它在骨吸收过程中发挥重要的作用。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种—半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs），其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶K，它选择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原，除此之外还能降解骨基质中的骨桥接素（osteopontin）和骨连接素（osteonectin），是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的的一种半胱氨酸蛋白酶，它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种MMPs，是骨吸收过程中的一个关键酶。但本研究中各浓度的氟对破骨细胞的组织蛋白酶K表达影响较小，可能不是氟作用的靶点。本研究结果尚需在动物体内实验以及人体实验中验证。
小鼠RAW264.7细胞作为一种单核巨噬细胞系，是体外研究破骨细胞分化的经典细胞系，因为该细胞系可以在RANKL诱导的情况下稳定分化为形态和功能均成熟的破骨细胞。本研究发现：①时间与NaF浓度交互作用对RAW264.7细胞活力的影响：NaF浓度对RAW264.7细胞活力有抑制作用，但并未使细胞死亡，而是细胞活性降低。随着时间延长，细胞活性逐渐增强，说明NaF对RAW264.7细胞活力的抑制是暂时性的，随着时间的延长NaF对RAW264.7细胞活力 的 抑 制 作 用 在 减 弱 。 ② 本 实 验 未 见 NaF 对RAW264.7 细胞活力有促进作用。NaF 只是暂时取代了RAW264.7细胞与活力有关的代谢因子，如果NaF浓度与此因子相当，则代谢平衡不变；如NaF浓度为20 mg/L（浓度高或低），与此因子浓度不相当，则暂时打破了这种平衡，但这种取代可能是可逆的，随时间延长而恢复，即NaF对RAW264.7细胞的作用是有限的。这种因子可能与RAW264.7细胞的周期活动相关的基因有关。龙丽、马雷等研究发现，氟对破骨细胞的作用剂量过低（F含量远小于1 mg/L），所得结果与常识不符合，很可能与选择兔细胞有关。本研究的结果与华坤、范哲和杜光等的研究基本一致，区别在本研究的剂量范围较广。氟对破骨细胞具有直接的作用，从细胞活力看，早期（24 h）以损伤作用为主，但在48 h显示细胞从损伤状态恢复。
MMP-9 主要在破骨细胞、骨髓单核细胞和一些骨基质表面衬细胞中表达。MMP-9通过降解细胞外基质，在破骨细胞的迁移、侵蚀和锚着过程中发挥作用，应用免疫组织化学方法观察氟对培养的大鼠破骨细胞MMP-9的影响，结果表明，随染氟剂量的增加，MMP-9阳性细胞数逐渐增多，以10mg/L、20mg/L、40 mg/L 组最为明显，与对照组比较差异有统计学意义（t=6.51，P<0.05）。说明氟可通过提高MMP-9的蛋白质表达引起骨吸收活性的增加。
组织蛋白酶K（cathepsin K）属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成员，1999年克隆成功，又称作 cathepsin O2，cathepsin X，cathepsin O。与其他组织蛋白酶不同，组织蛋白酶K具有分解骨组织中主要胶原（Ⅰ型胶原）的端肽区及螺旋状结构的能力发挥降解骨胶原的功能。而Ⅰ型胶原蛋白是含量最多的骨基质蛋白，占整个基质的90%，它在骨吸收过程中发挥重要的作用。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种—半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs），其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶K，它选择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原，除此之外还能降解骨基质中的骨桥接素（osteopontin）和骨连接素（osteonectin），是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的的一种半胱氨酸蛋白酶，它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种MMPs，是骨吸收过程中的一个关键酶。但本研究中各浓度的氟对破骨细胞的组织蛋白酶K表达影响较小，可能不是氟作用的靶点。本研究结果尚需在动物体内实验以及人体实验中验证。
