谈丙戊酸钠对脊髓水平瘙痒感觉的调控作用

　　疼痛与瘙痒是躯体对内源性或外源性刺激产生的两种不同的躯体感觉，虽然二者之间的信号转导以及神经环路仍然没有明确的定论，但疼痛抑制瘙痒，疼痛的缓解可能引起瘙痒的观点已被广泛接受[1].现临床上广泛使用的组蛋白去乙酰化酶（ histone deacetylase,HDAC） 抑制剂，可通过减少HDAC 的表达抑制组蛋白的去乙酰化发挥内源性镇痛作用[2].本课题组的前期研究（ 待发表） 显示非特异性 HDAC 抑制剂丙戊酸钠（ sodium valproate,VPA） 抑制脊髓水平 HDAC2 的表达，虽可显着缓解神经损伤引起的痛觉过敏，但同时会引起剧烈的瘙痒行为学表现。该研究基于疼痛与瘙痒之间的关系，探讨 VPA 是否也通过 HDAC2 调控脊髓水平瘙痒感觉，进而参与脊髓水平疼痛 - 瘙痒的共同调节，以期为临床合理用药提供有价值的指导意见。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验动物 成年 SPF 级昆明种小鼠，雄性，重20 ~ 25 g,由安徽医科大学实验动物中心提供。动物饲养于（ 24 ±1） ℃和 12 h 光照/12 h 黑暗的昼夜节律，自由摄食摄水。

　　1. 2 试剂与主要仪器 注射用 VPA[赛诺菲（ 杭州） 制药有限公司，批号： A2270/2CA45]; 水合氯醛、生理盐水 （ 上海制药厂） ; 氯喹（ 美国 Sigma-Aldrich 公司） ; 反转录 PCR（ RT-PCR） 试剂盒（ 美国Invitrogen 公司） ; Electron Von Frey （ 美 国 IITC 公司） ; 视频记录仪（ 日本 Olympus 公司） ; 罗氏 LightCycler 480 荧光定量 PCR 仪（ 瑞士 Roche 公司） .

　　1. 3 方法

　　1. 3. 1 实验分组 实验一： 将昆明种雄性小鼠 48只随机分为 6 组： 神经病理性疼痛组（ SNI 组） 、假手术组（ Sham 组） 、瘙痒组（ CQ 组） 、瘙痒溶媒组（ NS组） 、疼痛瘙痒组（ SQ 组） 及空白对照组（ CON 组） ;CON、SNI、Sham、SQ 组在术前 1 d、术后 1、3、5、7、9、10 d 测 定 左 后 足 机 械 缩 足 阈 值 （ mechanical with-drawal threshold,MWT） ,CON、CQ、NS、SQ 组分别注射氯喹或生理盐水后观察小鼠舔舐右后足的时间。实验二： 昆明种雄性小鼠 16 只随机分为 SQ-V 组和SQ-N 组。SNI 模型分别于术后 5、6、7、8、9 d 早晚 8时注射 VPA（ SQ-V 组） 及 VPA 溶媒生理盐水（ SQ-N组） 2 次后测定疼痛行为学，于术后第 10 天测定MWT 后注射氯喹，观察瘙痒行为学表现。

　　1. 3. 2 建立 SNI 动物模型[3]成年昆明种小鼠经10% 的水合氯醛麻醉后，切开左后肢侧面皮肤，钝性分离股二头肌，暴露坐骨神经及其 3 个分支（ 胫神经、腓总神经和腓肠神经） ,分别双重结扎胫神经和腓总神经，在双重结扎中央切断，并分别去除末端2 ~ 4 mm的神经干，术中避免直接接触或者牵拉腓肠神经，保持其完整性。术后分层缝合伤口，抗生素抗炎处理。Sham 组则只暴露坐骨神经及其分支而不切断。其余处理方式同手术组。

　　1. 3. 3 鞘内注射的操作方法[2]左掌压住鼠身，拇中二指按压骼骨两侧固定，食指按在双侧骸骨前缘连线正中点皮肤上（ 可触知 L5 棘突） 指示进针位点，右手持 10 μl 微量进样器与脊柱上方约成 20°角于 L5-L6 间隙进针，针尖进入一侧棘突、横突间组织后减 10°角左右缓慢推进，以鼠尾出现突然侧向运运为成功标志（ 可能系触及相应运动神经所致） ,按 5 mg/kg[4]剂量注射容积 5 μl VPA 或 VPA溶媒生理盐水，时间约 5 s,然后缓慢拔出。注意进针深度约 4 mm,针头斜面向下，针尖触及椎骨有抵挡感。  

　　1. 3. 4 MWT 的测定[5]用 Electron Von Fery 测定小鼠的 MWT.将小鼠置于透明的有机玻璃箱中，底为 0. 5 cm ×0. 5 cm 孔径的铁丝网，待小鼠在有机玻璃箱中适应 30 min 后，Electron Von Frey Rigid tip 垂直正确安置在测定架上，空载条件下调零。刺激小鼠左侧足底，即时读数至抬腿或主动缩足，观察最大折力数据（ 用 g 表示） ,以此作为机械刺激疼痛敏感指标之一。每组动物每个时间点连续测 5 次取平均值。观察并记录各组间及组内的 MWT 差异。

　　1. 3. 5 舔足时间[6]的检测 使用视频记录仪记录小鼠的舔足时间，即小鼠用舌头舔舐右后肢踝关节以下部位的总时间（ 用 s 表示） .将小鼠先放置于有机玻璃箱中适应 30 min,随后在小鼠右侧足底皮内注射 200 μg/10 μl 氯喹或 10 μl 氯喹溶媒，立即放回玻璃箱中，并打开视频记录仪记录注射后30 min内的舔足时间，记录期间实验操作人员离开实验操作间。实验结束后，回放视频计算小鼠舔足时间。

　　1. 3. 6 RT-PCR 法检测 取各组小鼠脊髓 L4 - L6部位，液氮研磨，TRIzol 提取总 RNA 后 M-MLV 逆转录酶合成 cDNA.采用 Light Cycler 480 SYBR GreenI Master 试剂检测小鼠脊髓 L4 - L6 部位 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8 基因的相对表达量，实验独立重复 3 次。

　　1. 4 统计学处理 采用 Graph PAD Prism 5. 0 软件对实验数据进行统计分析，并生成统计图表。计量资料以珋x ± s 表 示。多 组 比较 采 用 One-Way ANO-VA,两两比较采用 Student' s t 检验，机械缩足阈值采用 Two-Way ANOVA（ 时间为组内因素，处理为组间因素） 分析，RT-PCR 结果采用秩和检验进行比较。

　　2 结果

　　2. 1 SNI 对疼痛行为学的影响 SNI 小鼠术后 1 d起 MWT 较 CON 组 小 鼠 MWT 明 显 降 低 （ F =109. 56,P < 0. 05） ,至第 5 天后仍处于较低水平，见图 1.

　　2. 2 正常及 SNI 小鼠对氯喹或 NS 的反应 CQ 组小鼠舔足时间较 NS 组舔足时间显着延长，SQ 组舔足时间明显低于 CQ 组（ F = 205. 64,P < 0. 05） .SQ-V 组舔足时间显着高于 SQ-N 组（ F = 209. 58,P< 0. 05） ,见图 2.

　　2. 3 VPA 对于 SNI 小鼠疼痛 - 瘙痒行为的影响连续5 d 鞘内注射 VPA 可以显着缓解 SNI 引起的MWT 下降（ F = 110. 78,P < 0. 05） ,但会引起小鼠舔足时间的明显延长（ F =209. 78,P <0. 05） ,见图3、4.

　　2. 4 HDAC2 在疼痛以及瘙痒条件下的表达 RT-PCR 结果提示 HDAC2 在神经病理性疼痛条件下表达明显上调（ Z =4. 532 7,P <0. 05） ,而在瘙痒条件下，HDAC2 表达明显下调（ Z =5. 074 3,P <0. 05） ,见图 5.

　　3 讨论

　　本课题组前期研究（ 待发表） 仅偶然观察到VPA 在缓解神经损伤引起的疼痛的同时会引起剧烈瘙痒，该研究在此基础上，进一步在分子水平上证实 HDAC2 也同时参与脊髓水平瘙痒感觉的调节，进而可以明确 HDAC2 参与脊髓水平疼痛 - 瘙痒的共同调节。

　　SNI 模型具有机械痛敏产生早、个体差异性小、持续时间长，术后可出现显着的机械痛觉异常，保留腓肠神经、不影响小鼠日常活动等优点，便于精确衡量镇痛药物引起的神经病理性疼痛的行为学表型变化。瘙痒模型独创性的建立在与疼痛模型相同的脊髓节段，减少了传统的颈背部注射氯喹诱导瘙痒模型[1]的混杂因素，可以更好的解释相同节段脊神经的交互支配作用。

　　HDAC 分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4 大 类，I 类 包 括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8; Ⅱ 类 包 括HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、 HDAC9、HDAC10; Ⅲ类包括 Sirt1 ~ Sirt7; Ⅳ类包括 HDAC11.Liang et al[7]已经证实 HDAC2 表达的上调参与脊髓水平痛觉过敏的形成。RT-PCR 实验中，本课题组重点关注Ⅰ类 HDAC,选取Ⅰ类 HDAC 进行 RT-PCR实验，研究显示Ⅰ类 HDAC 中仅 HDAC2 在疼痛模型中表达显着上调，在瘙痒模型中表达显着下调，证实了课题组的前期推测。

　　Liu et al[8]最早证明瘙痒的发生与脊髓水平的μ 阿片受体（ μ opioid receptor,MOR） 有关，并同时发现了与瘙痒相关的特异性受体胃泌素受体释放肽（ GRPR） .深入研究后显示 MOR 存在不同的受体亚型，并发现疼痛的调节与 MOR1 亚型有关，瘙痒与 MOR1D 亚型有关，MOR1D 通过与 GRPR 形成异二聚体而引起强烈的瘙痒感觉。

　　阿片受体是与痛觉过敏相关的经典受体，笔者推测，脊髓水平 HDAC2 的差异性表达可引起脊髓水平不同亚型阿片受体的差异性表达，即 MOR1 表达下调引起疼痛的减轻； MOR1D 表达上调，使得MOR1D-GRPR 异二聚体增多进而诱发瘙痒感觉的产生，但确切机制还有待进一步研究。

　　综上所述，通过外源性使用非特异性 HDAC 抑制剂 VPA 干预 SNI 引起的神经病理性疼痛，显示VPA 在缓解 神 经 病 理 性 疼痛 时 会 引起 瘙痒，提示HDAC2 参与脊髓水平疼痛 - 瘙痒的共同调节，但详细机制有待进一步研究。

　　参考文献

　　[1] Liu Q,Tang Z,Surdenikova L,et al. Sensory neuron-specificGPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-inducedpruritus[J]. Cell,2009,139（ 7） : 1353 - 65.

　　[2] Denk F,Huang W,Slidders B,et al. HDAC inhibitors attenuatethe development of hypersensitivity in models of neuropathic pain[J]. Pain,2013,154（ 9） : 1668 -79.

　　[3] Decosterd I,Woolf C J. Spared nerve injury: an animal model ofpersistent peripheral neuropathic pain[J]. Pain,2000,87 （ 2 ） : 149 - 58.

　　[4] Hylden J L,Wilcox G L. Intrachecal morphine in mice: a newtechnique[J]. Eur J Pharmacol,1980,67（ 2 - 3） : 313 - 6.

　　[5] 汤黎黎，陈家骅，鲁显福，等。 脊髓水平 TRPM8 激活参与疼痛- 瘙痒共病的研究[J]. 安徽医科大学学 报。 2014,49 （ 11 ） :1562 - 5.