论抗病毒药物与埃博拉疫苗的研究进展

　　1埃博拉病毒的简介
　　
　　埃博拉病毒属于丝状病毒科，在电子显微镜下呈纤维状“U”、“6”字形缠绕、成环或分枝，病毒粒子的长度一般在800纳米左右，不过有部分种类的长度可达1000纳米甚至更高[1].该科有两个重要的属即马尔堡病病毒属（Marburgvirus）和埃博拉病毒属（Ebolavirus）。马尔堡病毒被分成单独的一类，而埃博拉病毒目前为止至少可以分为5亚型，分别是扎伊尔埃博拉病毒（1976）、苏丹埃博拉病毒（1976）、雷斯顿埃博拉病毒（1989）、科特迪瓦埃博拉病毒（1994）和本迪布焦埃博拉病毒（2007），其中扎伊尔型、苏丹型和本迪布焦型对人类有高度致病性，科特迪瓦型因记载只有一位感染者而且康复所以没有计算致病性，雷斯顿型对人无致病性。马尔堡病毒的形态结构与埃博拉几乎一样，但是两者的抗原抗体反应不同，作为一种结构相近的病毒，通常将他们放在一起研究[1.4].埃博拉病毒是单股负链非节段RNA病毒，其基因组含有七个基因，编码1种包膜表面糖蛋白GP,2种基质蛋白VP24和VP40,4种核衣壳蛋白NP、VP35、VP30和RNA聚合酶（L）[2].病毒的基因组结构是3′.NP.VP35.VP40.GP.VP30.VP24.L.5′，每一种蛋白由单独的mRNA编码，基因两末端序列具有高度保守型和高度互补性，含有五聚体3′.UAAUU.5′，多数基因被非保守的基因间隔开。病毒GP蛋白在介导病毒接触进入宿主细胞以及之后会引起宿主凝血障碍，因此GP蛋白序列成为了埃博拉疫苗设计的靶标。

　　自从上世纪70年代发现埃博拉病毒以来[5],历史上已报道数十次疫情暴发，2014年暴发于西非的疫情[6,7]是最凶猛的一次。根据世界卫生组织的统计数据，截至2014年12月22日，8个国家共报告了接近19340例病例，其中有7518人死亡，尽管有一些维持性治疗手段在一定程度上减缓了疫情，但埃博拉致死率仍达40%之高[8].
　　
　　2埃博拉疫苗研究进展
　　
　　埃博拉病毒发现至今已经38年，然而仍然没有有效疫苗上市。每次疫情暴发之后关于抗埃博拉药物和疫苗的研究才引起人们的重视。以前大部分疫苗研究仅仅停留在动物试验阶段，最前沿的是非人类灵长类动物实验。

　　2014年西非疫情大暴发后，世界各国都投入大量经费、集结大批科研人员展开了对埃博拉疫苗和药物的研究。在疫苗研究方面，美国和加拿大率先研发的疫苗已经应用于临床，在其他国家包括中国相关研究也取得了阶段性进展。

　　2.1 ChAd3.ZEBOV
　　
　　ChAd3.ZEBOV疫苗是由英国葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline,GSK）以及美国国家过敏症和传染病研究所（（National Instituteof Allergy and Infectious Diseases,NIAID）联合开发的首个埃博拉疫苗。该疫苗是以复制缺陷型的3型黑猩猩腺病毒（ChAd3）为载体，将腺病毒的糖蛋白基因替换成埃博拉病毒（扎伊尔型或苏丹型）的糖蛋白基因，递送Ebola病毒的GP.在腺病毒载体埃博拉疫苗研究方面作出重要贡献的是NIAID疫苗研究中心的Sullivan团队。由于非洲90%以上人口对腺病毒有预存免疫，Ad5侵入人体后，在埃博拉表面蛋白产生免疫应答前Ad5已被部分清除，因此在研究历程中多次更换了病毒载体。该团队首先使用人腺病毒（Ad5.GP）疫苗进行动物感染实验，结果产生的免疫免疫保护时间仅仅能维持4周[9],后来换用低血清阳性的3型黑猩猩腺病毒载体进行试验，免疫保护时间提高到了5周，证明选用低血清阳性的腺病毒作为疫苗载体可能解决预存免疫的问题。为延长保护时间，研究组使用了primer.boost免疫策略，在第八周接种安卡拉型牛痘病毒（MVA）埃博拉疫苗，实现100%免疫保护。目前该疫苗已进入临床一期的第二阶段，评估在免疫保护中的安全性和有效性。

　　2.2 rVSV.ZEBOV rVSV.ZEBOV疫苗是以复制性疱疹口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）为载体的重组疫苗[10],由加拿大公共卫生局研发和美国纽琳基因公司（NewLink）获得了商业许可。早在2013年Chad E.Mire团队研发了以VSV为载体 的rVSV.BEBOV.GP、rVSV.SUBOV.GP和rVSV.ZEBOV.GP三种重组疫苗，并进行了非人类灵长 类 动 物 水 平 交 叉 免 疫 反 应 实 验，发 现 接 种rVSV.SUBOV.GP 14d后再接种加强型rVSV.ZE.BOV.GP和仅使用rVSV.BEBOV.GP的免疫反应结果几乎相同[11],由此可见加强型rVSV.ZEBOV.GP更有可能作为西非埃博拉疫情的疫苗。然而在日内瓦大学医院开展临床试验时，由于志愿者在注射疫苗后出现关节炎等症状，瑞士日内瓦大学医院于2014年12月宣布暂停该疫苗的临床试验。

　　2.3 MVA.BN MVA.BN疫苗是一种利用减毒型安卡拉牛痘病毒作为载体的重组疫苗，可编码线状病毒表面糖蛋白抗原[12].强生公司现在正在与美国国家卫 生 研 究 院 （NIH）合 作，在2015年1月MVA.BN进入小范围临床试验，计划在2015年4月有40万份疫苗用于临床研究[13].
　　
　　2.4 DNA疫苗Devon J Shedlock研究组2013年研发的埃博拉DNA疫苗pEBOZ E.DNA,对非灵长类动物有很好的保护作用，40μg剂量的pEBOZ E.DNA即可100%保护1 000倍半致死浓度埃博拉病毒攻击的小鼠[14.15].Inovio制药公司将与GeneO.ne公司合作，在2015年上半年正式开展一期临床试验。

　　2.5我国科研团队相关进展2014年12月由中国人民解放军军事医学科学院下属生物工程研究所陈薇团队自主研发的重组埃博拉疫苗，通过了国家、军队联合评审，获得临床批件，将开展临床试验。该疫苗是全球首创冻干粉剂型，方便储存和运输，具备大规模生产技术条件[16],将成为继NIAID与GSK联合研发的ChAd3.ZEBOV疫苗、加拿大公共卫生局与美国NewLink公司共同开发的VSV.ZEBOV疫苗后，全球第三个进入临床的埃博拉疫苗。

　　3抗埃博拉病毒药物研究
　　
　　埃博拉病毒发现至今已有几十年，病毒基础结构和致病原因方面的研究资料匮乏使得抗病毒药物的研究还停留在基础阶段，近两年西非疫情大暴发加快了抗埃博拉药物研究的步伐，许多预防和治疗药物正处于临床或临床前阶段（表1），美国食品药品管 理 监 督 局 （Food and Drug Administration,FDA）批准了ZMapp等药物在紧急情况下可以用于确诊的埃博拉患者。

　　3.1 BCX.443
　　
　　0 BCX.4430是由NIAID出资，美国制药公司BioCryst研发的一种腺苷类似物[17],作为广谱的抗RNA病毒药物广泛应用于临床。该药物起初是治疗丙肝，后来发展成为潜在性治疗致死性丝状病毒（如埃博拉病毒、马尔堡病毒）的药物。

　　同位素试验表明，标记的BCX.4430进入细胞后首先被 磷 酸 化，然 后 被 细 胞 误 认 为 是 三 磷 酸 腺 苷（ATP）用于DNA或RNA的合成，病毒也不例外，在RNA合成过程中当BCX.4430加到病毒RNA链上后，其后续链无法继续合成，翻译和逆转录过程终止，病毒复制受到抑制[18].因此尽管细胞中可以检测到许多短链DNA或RNA,却由于不能行使特定的功能而被水解。

　　2014年9月，BCX.4430作为潜在的抗埃博拉病毒药物试验于小鼠和食蟹猴，结果证明该药物确实具有很好的抗埃博拉和马尔堡病毒的作用，甚至在感染48h后仍有很高疗效[19].因此，在西非抗击埃博拉过程中，在紧急情况下该药物可以用于埃博拉患者。

　　3.2 Brincidofovi
　　
　　r Brincidofovir是由Chimerix生物技术公司研发的一种脂质化的西多福韦。西多福韦是由吉利德公司开发的一种特效抗病毒药物，对许多DNA病毒感染的患者具有较好的疗效[20],曾经被美国政府看作生化武器恐怖袭击的储备用药，由于药物只能注射不能口服，且药物沉淀对肾脏损害较大，因而需要进一步改进。在NIAID的支持下，Chimerix生物技术公司对西多福韦进行改造，研究出了其衍生物Brincidofovir,也称为CMX001.与西多福韦相比，Brincidofovir除了具有更好的抗病毒疗效外，同时也大大降低了对肾脏的毒害作用[21].2014年10月，Chimerix公司得到了FDA的授权，在紧急情况下该新药可以试用于埃博拉患者。第一例埃博拉在美国本土被诊断后，Brincido.fovir作为抗埃博拉药物首次试用于患者，由于给药时患者病 症 已 相 当 严 重，患 者 在 服 药 后 第4d死亡[22].尽管如此，得到FDA授权后，Chimerix公司将于2015年1月在利比里亚对Brincidofovir的安全性、耐药性和疗效进行临床二期试验[23].
　　
　　3.3 TKM.Ebola
　　
　　 TKM.Ebola是由加拿大Tek.mira生物制药公司研发、美国Tekmira Pharmaceu.ticals Corp公司生产的一种抗埃博拉小分子RNA干扰剂。该药物是专门针对埃博拉设计的，其作用原理是，微小RNA分子在纳米脂质体包裹下在体内运输，进入细胞后结合到扎伊尔埃博拉病毒膜蛋白VP24、聚合酶辅助蛋白VP35和聚合酶蛋白L的基因上并将其沉默[24.25],从而抑制病毒的复制。动物实验表明，感染埃博拉病毒48h内给药，80%以上的灵长类动物能够存活；而在马尔堡病毒的研究中，存活率达到100%.该药于2014年7月成为首个被FDA批准的埃博拉病毒治疗药物。由于TKM.Ebola临床一期使用健康成年人做试验，细胞因子相关参数数据不足，目前该药仅限于紧急情况下对埃博拉病人使用[24].
　　
　　3.4 ZMapp
　　
　　 ZMapp是由美国Mapp生物制药公司开发的新型抗埃博拉药物，目前被认为是治疗埃博拉最好的药物。该药物是由三种单克隆抗体混制而成[26],生产过程比较复杂，首先使用埃博拉病毒一种蛋白感染小鼠使其产生免疫反应，然后分离纯化抗体并对其核酸序列进行分析并加以修饰改造，合成与人抗体相类似的基因片段，最后将人工合成的基因导入烟草植物，利用植物细胞表达抗体[27].由于烟草种植周期长、操作过程繁琐，抗体的产量较低，但是目前试验结果相当乐观[28].18只恒河猕猴平均分成3组，每组6只分别在感染埃博拉3d、4d和5d后给药，对照组的3只感染后不做处理。结果发现，对照组的猴子全部死亡，用药组的猴子全部存活下来[29],这说明ZMapp在灵长类动物体内确实有良好的抗埃博拉病毒作用。另外，亚特兰大的两名患者通过ZMapp和其他辅助药物治疗以及强有力的支持性治疗之后病情缓和许多，后来又有7名患者用药，其中5人康复。尽管在非人类的灵长类动物试验中ZMapp确实有相当好的疗效，但由于病毒具有突变性，而且更多关乎人治疗数据还没得到，因此ZMapp的疗效和安全性还需要进一步确认。

　　然而不幸的是，ZMapp生产周期长且生产效率极低，目前尚未能广泛用于埃博拉感染患者的治疗。

　　3.5 jk.05
　　
　　中国军事医学科学院微生物流行病研究所生防药物研究室王洪权研究员领衔的科研团队历时5年研制的药物jk.05通过了总后卫生部专家评审，被认为是中国首个抗埃博拉病毒药物[16].jk.05是一种小分子化学药物，该药能够选择性地抑制埃博拉病毒RNA聚合酶，从而抑制病毒复制。研究表明，该药在细胞和动物水平试验中具有抗埃博拉病毒活性，目前已进入临床试验。该药主要用于治疗由RNA病毒感染引起的疾病（包括埃博拉）。

　　其分子结构与法匹拉韦颇为相似，被认为是法匹拉韦的仿制药。

　　结语
　　
　　对于埃博拉，目前仍有许多问题亟待解决，如天然宿主和中间宿主还未完全确定，病毒与宿主的相互作用的分子机理不明，有效疫苗和治疗药物仍未找到。尽管21世纪人类进入了分子生物学时代，但是抵抗埃博拉疫情，最直接最有效的方法还是隔离。

　　许多国家和机构已经对埃博拉展开了研究，并取得了一些阶段性成果，多种疫苗和新药进入了临床试验阶段。各国和地区联合对患者进行隔离治疗，阻止了病毒进一步蔓延。鉴于感染地区病毒的减毒突变，以及许多患者体内出现了阳性抗体，埃博拉疫情目前趋向缓和。