二氢叶酸合成酶的磺胺类药物多残留快速检测分析
来源：UC论文网2015-11-04 15:19
摘要：
第一章引言 1.1研究目的和意义 抗菌药物是兽医临床治疗及作为促生长词料添加剂而应用最为遍及的一类药物。动物源食品中抗菌药物残留超标，不但直接威胁人类康健和生命宁静，同
第一章引言
1.1研究目的和意义
抗菌药物是兽医临床治疗及作为促生长词料添加剂而应用最为遍及的一类药物。动物源食品中抗菌药物残留超标，不但直接威胁人类康健和生命宁静，同时诱导动物食源细菌孕育发生耐药性，通过耐药基因通报到人类致病菌，低落抗菌药物疗效，严峻危害人类康健和生态情况[1，2]。为了进步大众康健程度，天下列国纷纷订定相干尺度和法例，限定乃至克制某些抗菌药物的利用和在动物源食品中的残留。对付某些可以利用的抗菌药物，也严酷划定了其利用范畴、最高残留限量和休药期等尺度。除了从源头上控制抗菌药物的不公道利用乃至滥用，实时、正确的检测动物源食品中药物残留是保障宁静的紧张的关键。因此，创建轻便、快速、敏捷、广谱的残留检测要领，对付人类康健和生态情况具有现实意义。
磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学药物，种类达到数千种，其中应用较广并有确切疗效的有数十种，由于其价格便宜、使用方便，广泛应用于动物疾病防治和促生长p，4]。然而，磺胺药物残留引发的一系列问题日益凸显，为此欧盟、加拿大和美国规定磺胺药物MRL值为100 ng mL_i[5]，日本规定其MRL值为20 ng mL,。从2005年，我国农业部把畜产品中磺胺类药物的残留状况作为继盐酸克伦特罗（瘦肉精)之后的又一个监控重点["^。目前，检测磺胺药物残留的方法主要有微生物法、理化分析方法和免疫分析方法，相对于前两种方法免疫分析方法适用于大量样本的快速分析、灵敏度高、成本低、不需要昂贵的仪器和复杂的技术，是目前应用最为广泛的一种检测方法。但是，目前的免疫分析技术和产品多基于传统抗体（单抗或多抗），一次仅分析单个或少数几个兽药，制约了兽药多残留快速检测技术发展。
受体蛋白理论上可以结合所有对应配体，是一类药物真正意义上的广谱别材料，是突破制约的方式之一。本研究以磺胺类药物受体蛋白二氢叶酸合成酶为研究对象，建立基于二氢叶酸合成酶的快速检测方法检测牛奶中磺胺类药物多残留。同时，为进一步提高方法灵敏度，通过分子对接技术研究二氢叶酸合成酶与磺胺类药物作用机制，为蛋白体外进化突变提供理论依据。
...................................
1.2磺胺类药物
1.2.1概述
磺胺类药物可以根据内服后吸收情况分为三类：肠道易吸收磺胺、肠道难横胺和外用磺胺。常用磺胺结构及分类，如表1-1所示。
1.2.2理化性质
磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦，遇光易变质，色渐变深，大多数本类药物在水中溶解度极低，较易溶于稀碱，但形成钠盐后则易溶于水，其水溶液呈强碱性。易溶于沸水、甘汕、盐酸、a氧化钾及氮氧化钠溶液，不溶于氣仿、乙醚、苯、石油醚。
1.2.3作用机制
细菌体内的二氢叶酸合成酶催化对氨基苯甲酸生成叶酸合成的中间产物，如图1-2所示，擴胺药与对氨基苯甲酸在分子大小和电荷分布方面相似，在细菌体内与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成藤的反应位点，抑制叶酸的合成，进而抑制了细菌的生长繁殖。磺胺并没有杀死细菌，只起到抑制作用，还要靠动物或人体免疫系统杀死细菌。动物或人类不能合成叶酸而必须从食物中获取叶酸，因此磺胺类药物不会影响人体细胞的叶酸代谢。
......................................
第二章磺胺类药物受体蛋白DHPS制备及鉴定
2.1试验材料
2.1.1菌株
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae R6)购自美国菌种保藏中心（American TypeCuLture Collection. ATCC)，编号 49619。大肠杆菌(Escherichia coif)购自自美国菌种保藏中心（American Type CuLture Collection，ATCC)，编号 25922。
2.1.2试剂
pET-28b载体 德国Merk公司
大肠奸菌Trans5(x 北京全式金生物有限公司
大肠杆菌BL210OE3) 日本Takara公司
T4 DNA Ligase试剂盒 美国Promega公司
His ? Bind? Columns 德国 Merk 公司
Nde I 日本Takara公司
Xho I 日本Takara公司
PCR Mix 日本Takara公司
pEASY-El Expression Kit 北京全式金生物有限公司
细菌基因组提取试剂盒 天根生物科技有限公司
DNA胶回收试剂盒 天根生物科技有限公司
质粒提取试剂盒 天根生物科技有限公司
卡那霉素 天根生物科技有限公司
琼脂糖 天根生物科技有限公司
IPTG 天根生物科技有限公司
X-Gal 天根生物科技有限公司
DNA Marker 天根生物科技有限公司
蛋白 Marker MBI Fermentas 公司
LB培养基 北京陆桥技术有限公司
两稀酷胺 上海生工
N，N-甲叉双丙稀酰胺 上海生工
Tween-20 广州天马精细化工
过硫酸钱 北京拜尔迪生物公司
硝酸纤维素膜 MiUipore公司
考马斯亮蓝G-250 Amresco公司
SDS Amresco 公司
Tris-HCl Amresco 公司
Tris Amresco 公司
甘氣酸 Amresco公司
TEMED Sigma 公司
Anti-His antibody 天根生物科技有限公司
增强型HRP-DAB底物显色 天根生物科技有限公司
Goat anti-mouse IgG - HRP 美国 Bio-Rad 公司
...................................
2.2试验方法
2.2.1重组克隆载体pEASYTM-Tl-y^p的构建及鉴定
2.2.1.1基因组DNA提取
采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取肺炎链球菌R6的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)将5mL肺炎链球菌菌株接种于培养基中，37°C，200 rpm震荡培养过夜。
(2)取细菌培养液5mL，10000 rpm离心1 rain，弃上清液。
(3)向菌体沉淀中加入200mL缓冲液GA,震荡至菌体彻底悬浮。 /> (4)向悬浮的菌体中加入蛋白酶K20 mL,混匀。
(5)加入220mL缓冲液GB，震荡15s，7(rC放置10 mim待溶液变清，简短离心以除去管内壁水珠。
(6)加入220^lL无水乙醇，震荡15s，简短离心除去管内壁水珠。
(7)将以上混悬液加入到吸附柱CB3(吸附柱放在干净的收集管中），12000 rpm离心30 S,倒掉废液将吸附柱CB3放到收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入500nL缓冲液GD，12000rpm离心30 s，倒掉废液后将吸附柱CB3放到收集管中。
(9)向吸附柱CB3中加入600mL漂洗液PW，12000rpm离心30 s，倒掉废液将吸附柱CB3放到收集管中。
(10)重复操作步骤9.
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2 mim倒掉废液，将吸附柱CB3放置室温15 min瞭干吸附材料中的残余漂洗液。
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50mLddHzO静置12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
..........................................
第三章 基于DHPS磺胺类药物多残留微孔检测方法的建立.................. 55-83
3.1 试验材料 ..............................55-59
3.2 试验方法................. 59-63
3.3 结果与分析..................... 63-77
3.4 讨论 ..........................77-82
3.5 小结 ....................................82-83
第四章 基于受体DHPS磺胺类药物多残留荧光偏振检测方法的建立 ..................83-102
4.1 试验材料 ....................................83-86
4.2 试验方法 ...........................86-89
4.3 结果与分析 ..........................89-97
4.4 讨论 ...............................97-101
4.5 小结 ....................................101-102
第五章 DHPS与磺胺类药物相互作用研究
在第二章的研究中体外表达了 DHPS，第三章建立了基于DHPS的横胺类药物的微孔板检测方法，可检测29种药物的残留，且检测限均低于MRL。大多数药物的IQ。值都在lOng左右，而SMP和SDZ的IC5。值在20ngmi;i，为了从结构层面解释这个现象出现的原因，我们通过分子对接确定DHPS与磺胺类药物相互作用及参与作用的关键氨基酸残基。Achari等[8力首次获得来源于大肠杆菌的DHPS晶体结构，并获得酶与SMZ复合物晶体复合物，Levy等首次获得来源于肺炎链球菌的DHPS晶体结构。本研究中，我们通过计算机模拟的方式研究六种購胺类药物与DHPS的作用模式，找出参与作用的关键氨基酸，为后续蛋白功能分析及体外进化奠定结构基础。
5.1试验材料
来源于肺炎链球菌R6的DHPS蛋白和酶标物根据第二章和第三章方法制备。软件模块：Sybyl-X-2.0 中 Surflex-dock 模块
5.2试验方法
5.2.1测定相对亲和力
以相对亲和力（Relative Binding Affinity，RBA)作为判断DHPS与擴胺药物的结合能力的指标。
(1)包用包被液将DHPS稀释成适当浓度加至酶标板，lOOuL/孔，37X：解育2h。
(2)洗漆：倾去孔内余液，用洗漆液洗1遍，300nL/孔，在吸水纸上拍干。
(3)封闭：加入封闭液150^1/孔，37°C辉育Ih，取出后直接拍干。
(4)加样：各孔先加入50 mL系列浓度的擴胺类药物标准品，再加入50^lL稀释成适当浓度的酶标记物，371：孵育3011〗111。
(5)洗漆：倾去孔内余液，用洗液洗4遍，300nL/孔，在吸水纸上拍干。
(6)显色：加入新鲜配制的TMB溶液，lOOuL/孔，避光37°C显色lOmin。
(7)终止：加入 2MH2SO4，50nL/孔。
(8)测定：用酶标仪读取各孔0D450 nm (双波长：630 nm为参考滤光片波长。
(9)计算各种药物的IQ。值；以SQX为参照，计算相对亲和力，如公式5-1。RBA% = ICsoCSMM)/ ICsoC 目标物）公式 5-1
.............................
结论
6.1制备了磺胺类药物受体蛋白DHPS
体外扩增来源于肺炎链球菌和大肠杆菌的floP基因，表达纯化了来源于肺炎链球菌R6和大肠杆菌ATCC 25922的DHPS-100 mL大肠杆菌培养物可获得约3 mg目的蛋白DHPS。经SDS-PAGE和Westera-Blotting验证后为目的蛋白。
6.2建立了基于DHPS的磺胺类药物微孔板式检測方法
建立了基于DHPS的磺胺类药物多残留微孔板式检测方法。本方法可以同时检测牛奶中SM2、SMZ、SQX> SDM 和 SMM 等 29 种擴胺药物，其 IQ。值为 2.95-56.22 ng mL—i，均低于MRL。纯牛奶中5种药物,31^12、51^2、5(^、30^1和SMM的添加回收率为83.3%~108.8%，变异系数为1.1%~15.8%;脱脂奶的添加回收率为72.7%~129.3%，变异系数为3.0%~16%。
6.3建立了基于DHPS的请胺类药物FPIA检測方法
建立了一种基于DHPS的FPIA检测方法，可以同时检测29种擴胺类药物。以来源于肺炎链球菌R6的DHPS和CS-BDF为核心试剂建立FPIA法检测牛奶中擴胺药物多残留。29种擴胺药物的ICso值为4.90 ngmi;i~108.24ngmlA脱脂牛奶中五种擴胺药物，SM2、SMZ、SQX、SDM和SMM的回收率为53.31% ~ 101.92%，变异系数为0.29%~ 19.77 %,基本可以满足残留检测要求。
6.4研究了 DHPS与磺胺类药物的相互作用
研究了 DHPS与6种擴胺药物间的相互作用，计算了结合的相对亲和力；利用Surflex-X-2.0对DHPS与6种磺胺进行对接研究，并给出评分，评分结果与相对亲和力的趋势基本一致；发现了 DHPS与擴胺类药物作用的2个重要氨基酸残基ne272和Asp221，疏水作用力是两者相互作用的决定因素。
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参考文献（略）
1.1研究目的和意义
抗菌药物是兽医临床治疗及作为促生长词料添加剂而应用最为遍及的一类药物。动物源食品中抗菌药物残留超标，不但直接威胁人类康健和生命宁静，同时诱导动物食源细菌孕育发生耐药性，通过耐药基因通报到人类致病菌，低落抗菌药物疗效，严峻危害人类康健和生态情况[1，2]。为了进步大众康健程度，天下列国纷纷订定相干尺度和法例，限定乃至克制某些抗菌药物的利用和在动物源食品中的残留。对付某些可以利用的抗菌药物，也严酷划定了其利用范畴、最高残留限量和休药期等尺度。除了从源头上控制抗菌药物的不公道利用乃至滥用，实时、正确的检测动物源食品中药物残留是保障宁静的紧张的关键。因此，创建轻便、快速、敏捷、广谱的残留检测要领，对付人类康健和生态情况具有现实意义。
磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学药物，种类达到数千种，其中应用较广并有确切疗效的有数十种，由于其价格便宜、使用方便，广泛应用于动物疾病防治和促生长p，4]。然而，磺胺药物残留引发的一系列问题日益凸显，为此欧盟、加拿大和美国规定磺胺药物MRL值为100 ng mL_i[5]，日本规定其MRL值为20 ng mL,。从2005年，我国农业部把畜产品中磺胺类药物的残留状况作为继盐酸克伦特罗（瘦肉精)之后的又一个监控重点["^。目前，检测磺胺药物残留的方法主要有微生物法、理化分析方法和免疫分析方法，相对于前两种方法免疫分析方法适用于大量样本的快速分析、灵敏度高、成本低、不需要昂贵的仪器和复杂的技术，是目前应用最为广泛的一种检测方法。但是，目前的免疫分析技术和产品多基于传统抗体（单抗或多抗），一次仅分析单个或少数几个兽药，制约了兽药多残留快速检测技术发展。
受体蛋白理论上可以结合所有对应配体，是一类药物真正意义上的广谱别材料，是突破制约的方式之一。本研究以磺胺类药物受体蛋白二氢叶酸合成酶为研究对象，建立基于二氢叶酸合成酶的快速检测方法检测牛奶中磺胺类药物多残留。同时，为进一步提高方法灵敏度，通过分子对接技术研究二氢叶酸合成酶与磺胺类药物作用机制，为蛋白体外进化突变提供理论依据。
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1.2磺胺类药物
1.2.1概述
磺胺类药物可以根据内服后吸收情况分为三类：肠道易吸收磺胺、肠道难横胺和外用磺胺。常用磺胺结构及分类，如表1-1所示。
1.2.2理化性质
磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦，遇光易变质，色渐变深，大多数本类药物在水中溶解度极低，较易溶于稀碱，但形成钠盐后则易溶于水，其水溶液呈强碱性。易溶于沸水、甘汕、盐酸、a氧化钾及氮氧化钠溶液，不溶于氣仿、乙醚、苯、石油醚。
1.2.3作用机制
细菌体内的二氢叶酸合成酶催化对氨基苯甲酸生成叶酸合成的中间产物，如图1-2所示，擴胺药与对氨基苯甲酸在分子大小和电荷分布方面相似，在细菌体内与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成藤的反应位点，抑制叶酸的合成，进而抑制了细菌的生长繁殖。磺胺并没有杀死细菌，只起到抑制作用，还要靠动物或人体免疫系统杀死细菌。动物或人类不能合成叶酸而必须从食物中获取叶酸，因此磺胺类药物不会影响人体细胞的叶酸代谢。
......................................
第二章磺胺类药物受体蛋白DHPS制备及鉴定
2.1试验材料
2.1.1菌株
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae R6)购自美国菌种保藏中心（American TypeCuLture Collection. ATCC)，编号 49619。大肠杆菌(Escherichia coif)购自自美国菌种保藏中心（American Type CuLture Collection，ATCC)，编号 25922。
2.1.2试剂
pET-28b载体 德国Merk公司
大肠奸菌Trans5(x 北京全式金生物有限公司
大肠杆菌BL210OE3) 日本Takara公司
T4 DNA Ligase试剂盒 美国Promega公司
His ? Bind? Columns 德国 Merk 公司
Nde I 日本Takara公司
Xho I 日本Takara公司
PCR Mix 日本Takara公司
pEASY-El Expression Kit 北京全式金生物有限公司
细菌基因组提取试剂盒 天根生物科技有限公司
DNA胶回收试剂盒 天根生物科技有限公司
质粒提取试剂盒 天根生物科技有限公司
卡那霉素 天根生物科技有限公司
琼脂糖 天根生物科技有限公司
IPTG 天根生物科技有限公司
X-Gal 天根生物科技有限公司
DNA Marker 天根生物科技有限公司
蛋白 Marker MBI Fermentas 公司
LB培养基 北京陆桥技术有限公司
两稀酷胺 上海生工
N，N-甲叉双丙稀酰胺 上海生工
Tween-20 广州天马精细化工
过硫酸钱 北京拜尔迪生物公司
硝酸纤维素膜 MiUipore公司
考马斯亮蓝G-250 Amresco公司
SDS Amresco 公司
Tris-HCl Amresco 公司
Tris Amresco 公司
甘氣酸 Amresco公司
TEMED Sigma 公司
Anti-His antibody 天根生物科技有限公司
增强型HRP-DAB底物显色 天根生物科技有限公司
Goat anti-mouse IgG - HRP 美国 Bio-Rad 公司
...................................
2.2试验方法
2.2.1重组克隆载体pEASYTM-Tl-y^p的构建及鉴定
2.2.1.1基因组DNA提取
采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取肺炎链球菌R6的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)将5mL肺炎链球菌菌株接种于培养基中，37°C，200 rpm震荡培养过夜。
(2)取细菌培养液5mL，10000 rpm离心1 rain，弃上清液。
(3)向菌体沉淀中加入200mL缓冲液GA,震荡至菌体彻底悬浮。
(5)加入220mL缓冲液GB，震荡15s，7(rC放置10 mim待溶液变清，简短离心以除去管内壁水珠。
(6)加入220^lL无水乙醇，震荡15s，简短离心除去管内壁水珠。
(7)将以上混悬液加入到吸附柱CB3(吸附柱放在干净的收集管中），12000 rpm离心30 S,倒掉废液将吸附柱CB3放到收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入500nL缓冲液GD，12000rpm离心30 s，倒掉废液后将吸附柱CB3放到收集管中。
(9)向吸附柱CB3中加入600mL漂洗液PW，12000rpm离心30 s，倒掉废液将吸附柱CB3放到收集管中。
(10)重复操作步骤9.
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2 mim倒掉废液，将吸附柱CB3放置室温15 min瞭干吸附材料中的残余漂洗液。
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50mLddHzO静置12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
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第三章 基于DHPS磺胺类药物多残留微孔检测方法的建立.................. 55-83
3.1 试验材料 ..............................55-59
3.2 试验方法................. 59-63
3.3 结果与分析..................... 63-77
3.4 讨论 ..........................77-82
3.5 小结 ....................................82-83
第四章 基于受体DHPS磺胺类药物多残留荧光偏振检测方法的建立 ..................83-102
4.1 试验材料 ....................................83-86
4.2 试验方法 ...........................86-89
4.3 结果与分析 ..........................89-97
4.4 讨论 ...............................97-101
4.5 小结 ....................................101-102
第五章 DHPS与磺胺类药物相互作用研究
在第二章的研究中体外表达了 DHPS，第三章建立了基于DHPS的横胺类药物的微孔板检测方法，可检测29种药物的残留，且检测限均低于MRL。大多数药物的IQ。值都在lOng左右，而SMP和SDZ的IC5。值在20ngmi;i，为了从结构层面解释这个现象出现的原因，我们通过分子对接确定DHPS与磺胺类药物相互作用及参与作用的关键氨基酸残基。Achari等[8力首次获得来源于大肠杆菌的DHPS晶体结构，并获得酶与SMZ复合物晶体复合物，Levy等首次获得来源于肺炎链球菌的DHPS晶体结构。本研究中，我们通过计算机模拟的方式研究六种購胺类药物与DHPS的作用模式，找出参与作用的关键氨基酸，为后续蛋白功能分析及体外进化奠定结构基础。
5.1试验材料
来源于肺炎链球菌R6的DHPS蛋白和酶标物根据第二章和第三章方法制备。软件模块：Sybyl-X-2.0 中 Surflex-dock 模块
5.2试验方法
5.2.1测定相对亲和力
以相对亲和力（Relative Binding Affinity，RBA)作为判断DHPS与擴胺药物的结合能力的指标。
(1)包用包被液将DHPS稀释成适当浓度加至酶标板，lOOuL/孔，37X：解育2h。
(2)洗漆：倾去孔内余液，用洗漆液洗1遍，300nL/孔，在吸水纸上拍干。
(3)封闭：加入封闭液150^1/孔，37°C辉育Ih，取出后直接拍干。
(4)加样：各孔先加入50 mL系列浓度的擴胺类药物标准品，再加入50^lL稀释成适当浓度的酶标记物，371：孵育3011〗111。
(5)洗漆：倾去孔内余液，用洗液洗4遍，300nL/孔，在吸水纸上拍干。
(6)显色：加入新鲜配制的TMB溶液，lOOuL/孔，避光37°C显色lOmin。
(7)终止：加入 2MH2SO4，50nL/孔。
(8)测定：用酶标仪读取各孔0D450 nm (双波长：630 nm为参考滤光片波长。
(9)计算各种药物的IQ。值；以SQX为参照，计算相对亲和力，如公式5-1。RBA% = ICsoCSMM)/ ICsoC 目标物）公式 5-1
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结论
6.1制备了磺胺类药物受体蛋白DHPS
体外扩增来源于肺炎链球菌和大肠杆菌的floP基因，表达纯化了来源于肺炎链球菌R6和大肠杆菌ATCC 25922的DHPS-100 mL大肠杆菌培养物可获得约3 mg目的蛋白DHPS。经SDS-PAGE和Westera-Blotting验证后为目的蛋白。
6.2建立了基于DHPS的磺胺类药物微孔板式检測方法
建立了基于DHPS的磺胺类药物多残留微孔板式检测方法。本方法可以同时检测牛奶中SM2、SMZ、SQX> SDM 和 SMM 等 29 种擴胺药物，其 IQ。值为 2.95-56.22 ng mL—i，均低于MRL。纯牛奶中5种药物,31^12、51^2、5(^、30^1和SMM的添加回收率为83.3%~108.8%，变异系数为1.1%~15.8%;脱脂奶的添加回收率为72.7%~129.3%，变异系数为3.0%~16%。
6.3建立了基于DHPS的请胺类药物FPIA检測方法
建立了一种基于DHPS的FPIA检测方法，可以同时检测29种擴胺类药物。以来源于肺炎链球菌R6的DHPS和CS-BDF为核心试剂建立FPIA法检测牛奶中擴胺药物多残留。29种擴胺药物的ICso值为4.90 ngmi;i~108.24ngmlA脱脂牛奶中五种擴胺药物，SM2、SMZ、SQX、SDM和SMM的回收率为53.31% ~ 101.92%，变异系数为0.29%~ 19.77 %,基本可以满足残留检测要求。
6.4研究了 DHPS与磺胺类药物的相互作用
研究了 DHPS与6种擴胺药物间的相互作用，计算了结合的相对亲和力；利用Surflex-X-2.0对DHPS与6种磺胺进行对接研究，并给出评分，评分结果与相对亲和力的趋势基本一致；发现了 DHPS与擴胺类药物作用的2个重要氨基酸残基ne272和Asp221，疏水作用力是两者相互作用的决定因素。
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参考文献（略）
